neurodevelopmental disorders (NDDs)
Gli esperimenti proposti mirano a ottenere una comprensione meccanicistica dei ruoli dell'esopolifosfatasi PRUNE1 e dell'ATPasi SRCAP nella regolazione della citochinesi, utilizzando diversi modelli genetici. PRUNE1 e SRCAP sono stati identificati come geni causativi di disturbi neurodevelopmentali complessi (NDDs) con fenotipi sovrapponenti (NMIHBA #617481 e DEHMBA #619595, rispettivamente). Le loro funzioni sono inoltre correlate alla progressione mitotica, in particolare durante la citochinesi e la separazione cellulare, principalmente grazie alla loro localizzazione subcellulare ai microtubuli e ai corpi intermedi, nonché alla loro interazione fisica con proteine mitotiche coinvolte nell’evento finale di separazione (es. CEP55 e Spastina). È importante sottolineare che alterazioni genetiche in entrambi i geni causano difetti mitotici e il fallimento della citochinesi.
Questa proposta aspira a rivelare come le alterazioni genetiche nei geni PRUNE1 e SRCAP conducano al fallimento della citochinesi e a difetti dello sviluppo, integrando diversi modelli genetici, tra cui: cellule epiteliali pigmentate retiniche umane diploidi immortalizzate con hTERT (RPE-1), fibroblasti primari umani derivati da biopsie cutanee, cellule progenitrici neurali di origine murina, Saccharomyces cerevisiae e Drosophila melanogaster. Inoltre, in questi modelli (wild-type vs mutanti) verrà adottato un approccio basato sulla proteomica per individuare potenziali alterazioni negli interattomi della citochinesi e dei corpi intermedi di PRUNE1 e SRCAP. Infine, S. cerevisiae sarà utilizzato per lo screening di librerie di composti alla ricerca di nuove molecole in grado di interferire con l’attività esopolifosfatasica della proteina mutante Prune1, con il potenziale di ripristinare il corretto processo di citochinesi nelle cellule mutate di topo e umane, anche in un contesto clinico futuro.
La proposta beneficerà della nostra esperienza e della disponibilità di tecnologie all’avanguardia, tra cui sistemi robotici per lo screening di composti, microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione in vivo e approcci di biologia cellulare che sfruttano la tecnologia CRISPR/Cas9 applicata a diversi modelli genetici. Nel complesso, il nostro progetto combinerà biologia cellulare e molecolare, editing genetico, degradazione mirata di proteine, registrazione video in time-lapse di cellule in divisione, analisi proteomiche, screening di librerie di composti ed esperimenti di ripristino funzionale.